الکتروفورز ژل آگارز
اساس تکنیک الکتروفورز ژل آگارز
بر اساس قوانین فیزیک وقتی جریان الکتریکی به محیطی شامل گونه های باردار مثبت و منفی اعمال می شود، کوره ازمایشگاهی انتظار می رود گونه ها به سمت بار مخالف خود حرکت کنند. این قانون ساده که همه ما با آن آشنایی داریم، اساس تکنینک الکتروفورز ژل آگارز است. این روش در علوم زیستی به طور گسترده استفاده می شود.
در ادامه این مقاله با تعریف الکتروفورز آگارز، چگونگی عملکرد و کاربرد های آشنا خواهید شد.
الکتروفورز ژل آگارز چیست؟
برای بستر ژل آگارز مناسب است، برای جداسازی قطعات نوکلوئیک اسید، DNA و RNA، استفاده می شود. روی طسح آگارز منافذی وجود دارد. پس از لود نمونه حاوی DNA یا RNA روی ژل آگارز و اتصال جریان الکتریکی به آن، این مولکول ها که دارای بار منفی هستند، به سممت قطب مثبت مهاجرت می کنند.
مولکول های آگارز با کنار هم قرار گرفتن، منافذ سه بعدی را ایجاد می کنند. بنابراین نوکلوئیک اسید هایی که تحت جریان الکتریکی قرار گرفته اند، بر اساس اندازه تفکیک خواهند شد. در واقع مولکول های کوچک تر سریع تر حرکت می کنند و مولکول های بزرگ تر در منافذ گیر می افتند. به این ترتیب نوار هایی از نوکلوئیک اسید ها طبق اندازه آن ها روی ژل ایجاد می شود. این نوار ها را با استفاده از تابش فرانبفش (UV) می توان مشاهده و تحلیل کرد.
هنگامی الکتروفورز در حال انجام می باشد به مرور دمای محیط پایه و بافرها افزایش می یابد که منجر به تبخیر حلال می گردد، این اثر سبب صعود بافر از هر دو بخش بافری به درون محیط پایه می گردد، این جریان دو طرفه بر حرکت یون ها تأثیر می گذارد.
چگونگی عملکرد الکتروفورز ژل آگارز
آگارز یک پلی ساکارید است که معمولا از برخی جلبک های دریایی قرمز استخراج می شود. مولکول های آگارز به صورت بسیار درهم پیچیده با پیونده های هیدروژنی کنار یکدیگر قرار گرفته اند. از بین کانال ها و منافذ ایجاد شده، مولکول های دیگری می توانند عبور کنند.
آگارز به صورتی پودری سفید رنگ است که در ترکیب با آب، پیوند های هیدروژنی بین مولکول ها تشکیل می شود. هنگامی که ژل آگارز گرم شود، پیوند ها شکسته و به مایع تبدیل می شود. دوباره می توان آن را داخل قالب ریخت.
درصد آگارز موجود در یک ژل بر اندازه منافذ و در نتیجه اندازه مولکول‌هایی که ممکن است از آن عبور کنند و سرعت عبور آنها تأثیر می‌گذارد. هرچه درصد آگارز بیشتر باشد، اندازه منافذ کوچک‌تر است، بنابراین مولکول‌ها کوچک‌تر می‌توانند عبور کنند و مهاجرت کند تر می‌شود. در آزمایشگاه های زیستی، ژل آگارز 0.7-1٪ معمولاً برای جداسازی DNA روزانه استفاده می شود، که تمایز خوب و واضح قطعات را در محدوده 0.2-10 کیلوبایت ارائه می دهد.
مولکول هایی که با الکتروفورز ژل آگارز تفکیک می شوند، مانند DNA، با چشم غیر مسلح قابل مشاهده نیستند. بنابراین هنگام ست کردن آن ها روی ژل از ترکیبات رنگی مانند اتیدیوم بروماید (EtBr) استفاده می شوند. مولکول های این رنگ به DNA متصل می شوند. با قرار گرفتن در معرض تابش UV خاصیت فلورسانس پیدا می کنند. هر چه DNA بیشتر باشد، نوار روشن تر می‌شود.
نمونه های مخلوط شده با رنگ روی یک انتهای ژل آگارز ست و در بافر غوطه ور می شوند. سپس یک جریان الکتریکی توسط الکترودهای هر انتهای مخزن ژل، از ژل عبور می کند. پس از این که به اندازه کافی مهاجرت انجام شد، با استفاده از نور UV و اندازه گیری های لازم، می توان نتایج الکتروفورز را تحلیل کرد.
مراحل تهیه ژل آگارز
- قالب ژل را آماده کنید.
- شانه ای با دنده های مناسب روی قالب قرار دهید.
- حجم ژل مورد نظر را تعیین کنید (اندازه گیری طول و عرض قالب و قطر ژل مورد نظر)
- پودر آگارز را وزن کنید.
- آگارز را در بافر حل کنید و آن را حرارت داده تا خوب بجوشد و قبل از خنک شدن به ازای هر ۱۰ میلی لیتر ژل یک میکرولیتر از محلول اتیدیوم بروماید اضافه کنید سپس آن را مخلوط کرده و داخل قالب بریزید.
- بعد از بسته شدن ژل آن را از قالب خارج کرده و داخل تانک الکتروفورز قرار دهید.
الکتروفورز ژل آگارز چه کاربردی دارد؟
- الکتروفورز ژل آگارز را می توان برای جداسازی مولکول ها بر مبنای بار یا وزن مولکولیشان استفاده نمود. مولکول هایی که بار الکتریکی بیشتری دارند، تحرک یا مهاجرت بیشتری از خود نشان می دهند و سریع تر منتقل می شوند.
- آگارز برای جداسازی اسید نوکلئیک ها و پروتئین های خیلی بزرگ استفاده می شود.
- برای جداسازی بر اساس بار، ژل آگارز مناسب است.
- معمولا برای تفکیک قطعات بزرگ (DNA بزرگتر از 500 جفت باز) درصورتی که هدف صرفا بررسی کیفی و تفکیک باشد، استفاده از ژل آگارز انتخاب اول است .
- یکی از مهمترین کاربردهای الکتروفورز ژل آگارز جداسازی بخش های حاصل از برش DNA با آنزیم های محدود کننده است.
- ژل آگارز می تواند پروتئین ها را بر اساس اندازه و بار تفکیک کند. (DNA و RNA دارای بار منفی هستند در حالی که بار پروتئین ها با توجه به آمینواسید های ساختار مشخص می شود.)
الکتروفورز ژل آگارز چه تفاوتی با پلی آکریل آمید دارد؟
- برای استفاده ژل آگارز باید از الکتروفورز عمودی استفاده شود. در حالی که الکتروفورز افقی مناسب آکریل آمید است.
- ژل آگارز به خاطر اندازه بزرگ منافذ، قدرت جداسازی و تفکیک پایین تری نسبت به اکریل آمید برای DNA دارد، اما دامنه جداسازی آن بسیار وسیع تر است.
- ژل آگارز نسب به آکریل آمید منافذ بزرگ تری دارد. بنابراین پلی آکریل آمید که منافذ کوچک تری دارد، وضوح بهتری از تفکیک پروتئین ها کوچک می دهد.
- تهیه ژل آگارز به مراتب سریع تر، آسان تر و کم هزینه تر از ژل پلی آکریل آمید می باشد.
